Gli esordi sul piccolo schermo
Caratterista alto e dallo sguardo affascinante, John Slattery appare sullo schermo nel 1988, come un membro del commando di Quella sporca dozzina. Partecipa poi a Undercover, altra serie tv, questa volta meno fortunata, della ABC mentre interpreta Al Kahn in Homefront, serie sulla seconda Guerra Mondiale uscita nel 1991. Durante i primi anni '90 Slattery alterna apparizioni in serie americane e film per la tv con ruoli sul palco di Broadway. È il caso di Laughter on the 23rd Floor. Appare poi in un'altra miniserie di successo: A Woman of Indipendent Means della NBC (1995).

La carriera al cinema
Il debutto sul grande schermo è con City Hall (1996) dove interpreta un detective di supporto in un film dal cast all stars, in cui recitano Al Pacino, Bridget Fonda e John Cusack. Il ruolo non gli impedisce di continuare una prolifica carriera televisiva: interpreta Walter Mondale in From the Eart to the Moon, miniserie della HBO del 1998, mentre interpreta il veterinario accanto a Ann Cusack in Maggie (1998). Sul grande schermo appare invece in Where's Marlow (1998) di Daniel Pyne.
Il caratterista John Slattery non abbandonerà mai il piccolo schermo, dove restano le sue interpretazioni più memorabili. È d'altra parte il fratello di Will in Will & Grace (1999) e appare in svariate serie di grande successo come Sex & the City (2000), Ed (2002), Law & Order (2000) oltre che, più recentemente, in Desperate Housewives (2007).
Sul grande schermo sarà invece il ragazzo di Julia Roberts in Mona Lisa Smile (2003), mentre nel 2004 appare in Dirty Dancing 2. Parteciperà dunque al dramma storico sulla seconda Guerra Mondiale girato da Clint Eastwood, Flags of our fathers (2006) e, nel 2007, interpreta Henry Cravely in La guerra di Charlie Wilson di Mike Nichols. Nello stesso anno è nel remake in carne e ossa del film tratto dal noto cartoon, Underdog, dove interpreta Mayor.
Nel 2011 torna ancora una volta sul grande schermo, al fianco di Matt Damon, nel film di George Nolfi I guardiani del destino e nel 2012 lo troviamo nel film scandalo di Alex Gibney sugli abusi della Chiesa Mea maxima culpa. Silenzio nella casa di Dio. Nel 2015 si dedica invece al thriller giornalistico Il caso Spotlight e alla fantascienza di Ant-Man di Peyton Reed.