Nato a Grand Island nel Nebraska nel 1905, il suo nome completo era Henry Jaynes Fonda.
Dopo aver studiato teatro e recitazione ad Ohoma, si laurea in giornalismo all'università del Minnesota. Nel 1925, incoraggiato da un'amica di famiglia (che era la madre di Marlon Brando), comincia a recitare in teatro debuttando a Broadway con grande successo. Scoperto dal produttore Darryl Zanuck, firma un contratto quinquennale con la Fox che lo fa esordire nei primi Technicolor dell'epoca. In breve tempo Fonda diviene uno dei divi più popolari, impersonando quasi sempre l'americano democratico e non violento, confermando sullo schermo i suoi ideali privati democratici e pacifisti. Solo sul finire della carriera si è prestato a produzioni lontane da quelle iniziali, dal filone dei western all'italiana sino ai film catastrofici degli anni Settanta.
Nella vita privata Fonda ha avuto cinque mogli ufficiali - Margaret Sullivan, Frances Seymour Brokaw, Susan Blanchard, Alfreda Fianchetti e Shirlee Mae Adams - e due figli d'arte avuti dal matrimonio con la Brokaw, Jane e Peter. Con la figlia Jane, i cui rapporti non sono stati sempre idilliaci per via di dissensi politici, Fonda ha recitato una sola volta, ne Sul lago dorato (1981), suo ultimo film e suo unico Oscar vinto.
Il suo solo, vero e fraterno amico nell'ambiente hollywoodiano, da lui disprezzato, è stato l'attore James Stewart, che gli era stato vicino fino al giorno della sua morte, avvenuta a New York nel 1982.