Luca Guadagnino si laurea all'Università La Sapienza di Roma, con una tesi sui film di Jonathan Demme. Un amore che trova punti di contatto con le sue opere e, soprattutto, con la sua concezione di cinema.
È dai primi anni Novanta, infatti, che Guadagnino lavora sulla forma del documentario, modalità operativa spesso prescelta anche dal cineasta americano per portare alla luce e ri-discutere Storia e storie oscure e trascurate. Algerie, uno dei primi lavori di Guadagnino, è presentato al Festival di Cinema Africano a Milano, nel 1996. L'anno successivo è la volta di Qui, un cortometraggio presentato al festival di Taormina dello stesso anno.
Guadagnino esordisce nel lungometraggio nel 1999, con l'esperienza di The Protagonists, un film un po' selvaggio e rivoluzionario del quale ricorda con nostalgia: "Eravamo verso la fine delle nostre riprese a Londra, stavamo girando la sequenza in cui Tilda Swinton si trova, cosparsa di sangue, a camminare per le vie della città. La scena richiedeva che Tilda stesse per alcuni lunghi minuti immobile dentro la vettura con il make-up addosso umido e appiccicoso. E ricordo che, poco prima del ciak, veramente qualche secondo prima, sento la voce di Tilda che mi chiama: vado da lei piuttosto agitato sperando che ciò che non va non sia troppo grave e lei invece mi dice: «Luca, lo sai che ti amo?», e poi aggiunge: «Dimmi, siamo una famiglia?». Una emozione grandissima, una vampata di amore così è una delle cose più belle che ti possono capitare quando fai un film. E in quella richiesta di Tilda di essere insieme, io, lei, il cinema una famiglia, risiede il segreto della nostra amicizia". E ancora: "Credo che né io né Tilda abbiamo mai pensato di catalogare il film che stavamo facendo (italiano, sperimentale...), era semplicemente The Protagonists, e forse l'eccentricità del progetto era la cosa più convincente per entrambi; pochi giorni prima di cominciare le riprese, in una terribile trattoria italiana a Londra, chiesi a Tilda se l'ultima stesura della sceneggiatura le "piacesse". Mi rispose che non era un questione di 'piacere', che non si poteva mettere in un ordine di valori verticale il lavoro che avremmo fatto, perché secondo lei, il fatto più importante era di produrre un lavoro organico e imprevedibile come questo. Chiuse la questione dicendomi: «dobbiamo fare film di guerriglia, altrimenti che bisogno c'è di fare il cinema». Tilda è una persona sorprendente per un quasi unico impasto di follia, ingenuità, dolcezza e generosità, trasandatezza e charme, intelligenza. Conosco poche persone nel cinema che come lei non si curano affatto di esserci, apparire. Stavamo pranzando in giardino e lei mi disse: «vivi ritirato e nella quiete, e sii selvaggio e rivoluzionario in ciò che crei".

Dopo altri lavori, cortometraggi o documentari spesso girati in video e a produzione autarchica, Guadagnino torna sul profilo pensante di Tilda Swinton con Tilda Swinton: The Love Factory (2002), presentato a Venezia. Trentacinque minuti di faccia-a-faccia con l'attrice londinese, in cui subiamo tutto il fascino, maieutico e fisico, che si presume l'attrice abbia esercitato prima di tutti con Guadagnino stesso, qui attento e partecipe 'ascoltatore' delle sue peregrinazioni verbali, dei suoi moti d'animo, delle sue divagazioni nostalgiche. Come documentarista, realizza poi Mundo civilizado (2003) e Cuoco contadino (2004), ottenendo riscontri positivi in festival e rassegne.
Nel 2005, esce il suo primo lungometraggio puramente di fiction, Melissa P., tratto dal best-seller scandalo ("100 colpi di spazzola prima di andare a dormire") di una giovanissima scrittrice catanese, alle prese con la personale scoperta del mondo del sesso.
Il giovane Guadagnino, regista sofisticato e cinefilo, amante di Demme quanto di De Palma, sfrutta parzialmente gli interessanti credits del film, come Geraldine Chaplin nel ruolo della nonna di Melissa, e ottiene un riscontro altalenante fra box office e critica. Nel 2010 torna al cinema per dirigere l'elegante pellicola Io sono l'amore con Tilda Swinton, Alba Rohrwacher, Marisa Berenson e Pippo Delbono. Il film è stato presentato alla Mostra del Cinema di Venezia nella sezione Orizzonti. Tornerà a Venezia cinque anni dopo - accompagnato ancora una volta dalla musa Tilda Swinton - per presentare A Bigger Splash, melodramma psicologico ambientato a bordo piscina.
Chiuderà poi la sua ideale trilogia sul desiderio con Chiamami col tuo nome (2017), tratto dal romanzo omonimo di André Aciman. Il film vincerà il premio Oscar per la miglior sceneggiatura non originale.
Dopo il remake di Suspiria (2018), nel 2020 realizza il cortometraggio Fiori, Fiori, Fiori!, filmato a Palermo e in Sicilia durante il lockdown nella pandemia di COVID-19, e presentato fuori concorso alla 77ª Mostra del Cinema di Venezia. Lo stesso anno esce su Sky la serie We are Who We Are.
Nel 2022 presenta alla 79. Mostra del Cinema di Venezia Bones and All, film che si aggiudica il Leone d'Argento.