Channing Tatum interpreta Duke Ispirato alla serie di comics americani scritti da Larry Hama, il live action di G.I. Joe: Rise of Cobra, sembra che non farà alcun riferimento alla serie animata a parte pochi particolari. Il produttore di Bonaventura ha rivelato che la voce del comandante Cobra non sarà così acuta come quella di Chris Latta (doppiatore americano di Cobra) nella serie animata, ma una via di mezzo tra questa e quella di Gordon-Levitt e con un tono più minaccioso. Un'altra modifica riguarda la maschera che indossa Cobra nella serie animata, modificata perché ricordava troppo il cappuccio del KKK (Ku Klux Klan). Secondo Gordon-Levitt, il film mantiene lo spirito della serie portando il personaggio a tre dimensioni, ma non pensa sia giusto fare una replica perfetta del cartone animato, perché se indossasse le stesse uniformi, il suo personaggio sembrerebbe ridicolo. Gordon-Levitt ha anche rivelato che il trucco di Cobra è costituito da molte protesi, rendendo possibile su di se, un utilizzo minimo degli effetti digitali.

Ray Park interpreta Snake Eyes Come si avvince dal titolo il film racconterà le origini della storia di Cobra, ma la trama ruoterà attorno a otto/nove personaggi, creando diverse sottotrame. In una di queste storie, verrà esplorata la relazione tra Snake Eyes (Ray Park) e Storm Shadow (Byung-hun Lee), il loro incontro a quando avevano 10 anni e i fatti che gli hanno divisi. Nonostante il film debba ancora uscire, è stata sfiorata una probabile rivolta da parte dei fan, a causa di una frase che avrebbe dovuto dire Snake Eyes a fine film. Il produttore di Bonaventura ammette che lo staff pensava di aver avuto una bellissima idea nel far parlare il personaggio a fine film, ma il creatore Larry Hama, che ha lavorato nella produzione della pellicola come consulente non è stato dello stesso avviso, dicendo che Snake Eyes non può dire nemmeno una parola indipendentemente da quello che pensano i creatori del film.