Lily Gladstone è cresciuta nel Montana, nella riserva di Blackfeet, e le sue origini risalgono sia alle tribù dei Blackfeet che a quella dei Nez Perce. Gladstone è emersa nel film di Kelly Reichardt del 2016 Certain Women, ottenendo nomination a diversi premi, fra cui gli Independent Spirit Awards come migliore attrice non protagonista, e i Gotham Awards come migliore attore esordiente. È stata nominata migliore attrice non protagonista del 2016 dalla Los Angeles Critics Film Association.
Nel 2023 è protagonista del film di Martin Scorsese Killers of the Flower Moon.
I suoi film più recenti comprendono Fancy Dance di Erica Tremblay, presentato al Sundance 2023 e The Unknown Country di Morissa Maltz, presentato nel 2022 al festival South by Southwest (SXSW). Altri crediti cinematografici comprendono: Quantum Cowboys di Geoff Marslett, First Cow della società di produzione indipendente A24 (in cui ha ritrovato il regista Reichardt), Winter in the Bloode Walking Out di Alex e Andrew Smith e il premiato Freeland.
È apparsa nel ruolo di Hokti nell'acclamata serie di Sterlin Harjo Reservation Dogs e presto sarà la protagonista, al fianco di Riley Keough, della serie di Samir Mehta e Quinn Shephard Under the Bridge,trasmessa in streaming sulla piattaforma Hulu. In Tvha avuto inoltre un ruolo ruolo ricorrente in Billions, in onda su Showtime.
Lily Gladstone vanta un ricco background in teatri prestigiosi fra cui: lo Yale Repertory Theater, l'Oregon Shakespeare Festival, il Montana Repertory Theater, e il New Group a New York.