È stato il primo direttore artistico del Globe Theatre di Shakespeare, la riproduzione del teatro costruita in luogo dell'originale, e ha conservato questo incarico dal 1995 al 2005. Nel corso di questi dieci anni, ha recitato in ognuna delle stagioni teatrali, mettendo in scena lavori di Shakespeare e dei suoi contemporanei. Rylance in precedenza aveva fatto parte della Royal Shakespeare Company ed è stato applaudito nei teatri della West End, al Royal National Theatre, alla Royal Opera House, e alla Royal Court. Ha vinto un Olivier Award come Migliore Attore.

La carriera cinematografica di Rylance comprende ruoli protagonisti in: Grass Arena di Gillies MacKinnon, che gli è valso il BBC Radio Times Award come Migliore Esordiente; Intimacy (Nell'Intimità), diretto da Patrice Chereau; The Institute Benjamenta dei Brothers Quay; Love Lies Bleeding di Michael Winterbottom; e Angels and Insects (Angeli e insetti), diretto da Philip Haas, in cui ha recitato al fianco di Kristin Scott Thomas. Di recente si è aggiudicato il BAFTA per il suo ritratto di Dr. David Kelly in The Government Inspector.
Attualmente è impegnato nella produzione di "Peer Gynt" al Guthrie Theatre di Minneapolis e presto apparirà a Broadway in "Boeing Boeing".