Johnny Whitworth nasce la notte di Halloween del 1975 a Charleston, in South Carolina, dove trascorre la sua infanzia in compagnia di sua madre, divorziata dal marito. Solo successivamente decide di andare a vivere con il padre a Dallas, in Texas.
Fra i quindici e i sedici anni, vince un concorso di bellezza e si trasferisce a Los Angeles con la madre in cerca di fortuna. È lì che conclude la sua istruzione diplomandosi alla Beverly Hills High School. A diciotto anni comincia a lavorare in televisione (Party of Five - Cinque in famiglia), ai quali si aggiungeranno diverse altre esperienze (The Shield, Providence, N.Y.P.D., Senza traccia, Numb3rs, Cold Case - Delitti irrisolti), fra i quali spicca CSI - Miami (2006-2010), all'interno del quale ha il ricorrente ruolo del detective Jake Berkeley.

Il debutto cinematografico
Nel 1995 debutta cinematograficamente nel film Mariti imperfetti con Matthew Modine, Randy Quaid, Paul Reiser, Janeane Garofalo, Amy Brenneman ed Eliza Dushku.
Dopo aver recitato con Nastassjia Kinski in Somebody Is Waiting (1996) e con Danny DeVito e Jon Voight nel film di Francis Ford Coppola L'uomo della pioggia (1997), continua ad aggiungere piccole partecipazioni anche a film indipendenti: Hell's Kitchen - Le strade dell'inferno (1998); La grande onda (1998); Valentine - Appuntamento con la morte (2001); e Factory Girl (2006).
Nel 2007 si è imposto all'attenzione del pubblico americano con il western Quel treno per Yuma di James Mangold, con Russell Crowe, Christian Bale, Peter Fonda, Gretchen Mol e Ben Foster, dove ha il ruolo di Darden; poi appare nei film Limitless (2011), con Robert De Niro e Ghost Rider: Spirito di vendetta (2012), con Nicolas Cage.

Vita privata
Dopo una relazione con Liv Tyler, conosciuta sul set di Empire Records (1995), è stato fidanzato con Gina Philips dal 1996 al 1999.