È una delle attrici più richieste di Hollywood, e vanta una brillante carriera al cinema, in televisione e al teatro. Di recente ha interpretato il film Watchmen, basato sulla nota graphic novel della DC Comic, e a teatro è andata in scena con il play Desire Under the Elms al Goodman Theatre di Chicago. Presto riprenderà il ruolo di Amanda nella serie di successo di HBO Entourage. Altri film da lei interpretati comprendono Righteous Kill (ì&), al fianco di Robert De Niro e Al Pacino, American Gangster, The Lookout (ì&), Night at the Museum (ì&) e Spy Kids (ì&).

La carriera cinematografica di Gugino è iniziata con un ruolo nel film Troop Beverly Hills (ì&). Subito dopo l’attrice ha interpretato Son in Law, This Boy’s Life, Miami Rhapsody (ì&), Michael, Snake Eyes (ì&) e The Singing Detective. Progetti imminenti della Gugino comprendono il film antologia New York, I Love You, Women in Trouble e Our Lady of Victory.
In televisione ha recitato nelle serie Threshold e Karen Sisco. I ruoli in Chicago Hope e nella sitcom Spin City hanno messo in mostra il versatile talento di Gugino sia nel genere drammatico che in quello comico.
All’inizio del 2007 Gugino ha ultimato una elogiata performance al fianco di Blythe Danner nella produzione del Roundabout Theater Company di Suddenly Last Summer. Ha esordito a Broadway nel revival del 2004 al Roundabout di After the Fall. Per la sua performance ha ricevuto numerosi premi, fra cui una nomination all’ Outer Critics Circle Award e al Theater World Award come Outstanding Broadway Debut.