Probabilmente ci sarebbe piaciuto vedere quel bacio che in What's Cooking? si scambiava in maniera così appassionante con Kyra Sedgwick, ma il film è rimasto inedito in Italia e noi la ricordiamo soprattutto per la vibrante interpretazione di un'infermiera del pronto soccorso di E.R. che le ha permesso di essere pluricandidata ai Golden Globe e agli Emmy, ma anche di confermare il suo talento di attrice. Talento che però scompare quando si tratta di scegliere ruoli per il grande schermo. Viso etnico, fisico non certo da modella, è grazie al tubo catodico che ha raggiunto la fama, con ritratti di donne quasi sempre emancipate e in mezzo all'azione.
Figlia di un pubblicitario e di un'insegnante di danza dell'American Ballet, sorella delle ballerine Alexandra e Rachel Margulies (la prima ha avuto anche qualche esperienza come attrice), dopo aver studiato alla High Mowing School di Wilton (New Hampshire), nel 1984, frequenta il Sarah Lawrence College nel 1989. Dopo aver vissuto fra Parigi e l'Inghilterra, comincia ad appassionarsi alla recitazione apparendo in spettacoli teatrale, poi si trasferisce per un brevissimo arco di tempo a Firenze.
Nel 1991, torna in Italia, dove debutta nel film Giustizia a tutti i costi (1991) di John Flynn, con Steven Seagal, William Forsythe e Jo Campa. Nel contempo, frequenta un corso di recitazione, ed è proprio lì che incontra il suo ragazzo l'attore Ron Eldard, con il quale rimarrà legata fino al 2003.
Intraprende una fortunata carriera televisiva, passando da Law & Order - I due volti della giustizia (1993) a piccole apparizioni ne La signora in giallo (1993) e Homicide, Life on the Street (1994), ma raggiunge il successo mondiale con il ruolo dell'infermiera Carol Hathaway nel serial drammatico della NBC E.R. - Medici in prima linea (1994-2000). Dopo 134 puntate, lascia il cast, stringendo nel suo pugno un Emmy come miglior attrice non protagonista in una serie drammatica. Per scongiurare la sua uscita dal telefilm, la produzione arrivò a offrirle 27 milioni di dollari, ma la Margulies preferisce trasferirsi a New York e cominciare a lavorare in teatro.
Prende parte a Paradise Road (1997) di Bruce Beresford, il quale rimarrà talmente colpito dalla recitazione della donna da imporla anche nel cast di Evelyn (2002). Rifiutati Face/Off (1997) e Anaconda (1997), sceglie il film indipendente Il prezzo dei rubini (1998) e la pellicola (pessimamente doppiata in Italia) The Newton Boys (1998). Sarà poi diretta da Gurinder Chadha in What's Cooking? (2000) e presterà la voce al dinosauro Neera in Dinosauri (2000).
Strega Morgana per il film tv Le nebbie di Avalon (2001), prende parte al film horror Nave fantasma - Ghost Ship (2003), poi ritorna nel piccolo schermo apparendo nei serial Scrubs (2004), I Soprano (2006-2007) e Canterbury's Law (2008) di Mike Figgis. La carriera nel grande schermo però si dimostra completamente sbagliata. La Margulies ha la particolarità di accettare pellicole decisamente dementi come Snakes on a Plane (2006), pellicola su un mucchio di serpenti che assaltano i passeggeri di un aereo, va leggermente meglio (per fortuna) con The Darwin Awards - Suicidi accidentali per menti poco evolute (2006).
