Luigi Lo Cascio inizia a recitare a metà degli anni Ottanta con un gruppo di teatranti di strada: i "Cabaret a scala", con i quali improvvisa spettacoli nelle piazze e nei vicoli della sua città natale. Nel 1989 ottiene una piccola parte in Aspettando Godot, messo in scena da Federico Tiezzi per il Teatro Stabile di Palermo, con il quale gira i teatri italiani più importanti. Dopo questa esperienza, decide di abbandonare la facoltà di medicina a cui si era iscritto due anni prima, con l'intenzione di diventare psichiatra, e si trasferisce a Roma dove frequenta l'Accademia di Arte Drammatica "Silvio D'Amico" diplomandosi nel 1992. Nel 1999 recita nella trilogia shakespeariana diretta da Carlo Cecchi. Durante questo spettacolo, Luigi Lo Cascio viene notato da Marco Tullio Giordana che lo sceglie per interpretare il ruolo di Peppino Impastato ne I cento passi. Il film, presentato a Venezia nel 2000, sorprende tutti per la straordinaria bravura del giovane esordiente che dona al ragazzo ucciso dalla mafia un corpo e un volto talmente intensi da commuovere pubblico e critica tanto da vincere il David di Donatello come migliore attore protagonista.

Nel 2001 vince la Coppa Volpi a Venezia per Luce dei miei occhi di Giuseppe Piccioni. Il premio sottolinea la maturità di un attore capace di esprimere con la stessa intensità sia il fervore "rivoluzionario" di Peppino Impastato sia la mite tenerezza di Antonio (il personaggio di Luce dei miei occhi) un timido autista che scoprirà il coraggio per amore di una donna. Sempre nel 2001 interpreta Il più bel giorno della mia vita scivolando nei panni di un omosessuale inquieto ma allo stesso tempo determinato a dichiarare la propria condizione alla sua famiglia. Il 2003 è l'anno della definitiva consacrazione, oltre a dividere la scena con Sergio Rubini in Mio cognato di Alessandro Piva, Lo Cascio è tra i protagonisti dei due maggiori successi della stagione: La meglio gioventù di Marco Tullio Giordana e Buongiorno Notte di Marco Bellocchio.