Lupita Nyong'o è nata in Messico, dove il padre, leader politico, era esule. È cresciuta in Kenya e si è laureata negli Stati Uniti (in Massachussetts) in Studi cinematografici e teatrali. Ha raggiunto la notorietà a soli ventisei anni grazie alla realizzazione del suo primo documentario, In my genes (2009), che affronta le discriminazioni subite dagli albini in Kenya, di cui è regista, produttrice e ideatrice. Il film ha vinto il premio come miglior documentario al Five College Student Film Festival, un consorzio universitario del Massachussetts ed è stato selezionato per il New York African Film Festival, lo Zanzibar International Film Festival, il Kenyan Film Festival. In precedenza ha lavorato come assistente alla produzione e attrice.

Grazie al suo esordio come attrice, in 12 anni schiavo di Steve McQueen, ruolo per cui si è aggiudicata l'Oscar 2014 come miglior attrice non protagonista, è diventata una star ed è stata scelta per la prossima campagna (primavera/estate 2014) di Miu Miu.
Recita poi accanto a Liam Neeson e Julianne Moore nel thriller di Jaume Collet-Serra Non-Stop, ambientato a bordo di un volo internazionale, e si aggiudica un ruolo nel blockbuster Star Wars: Episodio VII - Il risveglio della forza di J.J. Abrams, in uscita a dicembre 2015. Nel 2016 presta la voce a Rakcha nel capolavoro in motion capture targato Disney Pictures, Il libro della giungla.
Nel 2018 entra nel Marvel Cinematic Universe, interpretando Nakia in Black Panther, e l'anno successivo è protagonista del film di Jordan Peele Noi, e nel 2022 è nel film di spionaggio di Simon Kinberg Secret Team 355.