Avvocato a Milano, si avvicinò alla società Suvini e Zerboni, della quale, dopo aver abbandonato la professione forense, divenne segretario. Si occupò dapprima dell'organizzazione degli spettacoli di varietà e, successivamente, della loro messa in scena. Nel 1928 raccolse alcune compagnie sotto il nome di"Spettacoli Za Bum ", una sigla che divenne assai celebre in pochi anni. Esordì nella regia cinematografica nel 1934 con Tempo massimo, commedia brillante con Vittorio De Sica. Cominciò così una prolifica carriera di regista e sceneggiatore, che lo portò a realizzare un notevole numero di film, spaziando dal comico al dramma passionale al film mitologico. Le sue pellicole, spesso snobbate dalla critica, ottennero sempre ampi consensi da parte del pubblico. A portare al successo i suoi film furono soprattutto Erminio Macario ( Imputato, alzatevi!, 1939; Lo vedi come sei?, 1939, Non me lo dire!, 1940; Il pirata sono io!, 1940) e Totò ( Fifa e arena, 1948; Totòtarzan, 1950; Totò sceicco, 1950; Miseria e nobiltà, 1954; Signori si nasce, 1960). Sotto la sigla"I film che parlano al vostro cuore ", Mattoli realizzò negli anni '40 una serie di pellicole ispirate al cinema francese ( Luce nelle tenebre, 1941 ; Catene invisibili, 1942; Stasera niente di nuovo, 1942; Labbra serrate, 1942). Sapeva benissimo d'essere uno"spregevole"regista commerciale, e s'è sempre fatto un baffo della critica. Grazie alla sua grande genialità e al suo smisurato talento, Mario Mattoli ha regalato al cinema italiano capolavori della comicità, come i numerosi film che ha girato con Totò, i quali avevano, diceva lui,"una caratteristica, modestia a parte: incassavano molto di più di quel che costavano".