È stato definito uno degli attori italiani più conosciuti dal pubblico internazionale dai tempi di Mastroianni e Gassman. Oltre alla sua lunga carriera come interprete al cinema, in televisione e in teatro, Castellitto è anche un famoso sceneggiatore e regista, che ha visto il suo più recente impegno dietro alla macchina da presa, Non ti muovere> (in cui recitava con Penelope Cruz) diventare uno dei maggiori successi di critica e al botteghino in Italia nel 2004.
Castellitto e la Cruz si sono aggiudicati i David di Donatello per le loro interpretazioni, con la pellicola (basata sul fortunato romanzo vincitore del premio Strega scritto da sua moglie, l’acclamata autrice Margaret Mazzantini) che ha ottenuto altre nove candidature, tra cui quelle per il miglior film, la sceneggiatura e la regia per Castellitto. La pellicola è anche stata mostrata nel 2004 in una retrospettiva delle opere dell’attore e regista al Film Society of Lincoln Center.
Nato a Roma, Castellitto si è laureato all’Accademia nazionale di arte drammatica Silvio D'Amico nel 1978. Ha iniziato la sua carriera teatrale in Italia con Misura per misura> (Measure for Measure) di Shakespeare al Teatro di Roma e con altri ruoli nelle produzioni de La Madre di Brecht, Il mercante di Venezia> (Merchant of Venice) e Il candelaio> di Giordano Bruno. In seguito, ha lavorato al Teatro di Genova nel ruolo di Tuzenbach ne Le tre sorelle> di Cechov e in quello di Jean ne La signorina Giulia> di Strindberg, in entrambi i casi sotto la direzione di Otomar Krejka. Successivamente, ha partecipato alle produzioni teatrali de L'Infelicità senza desideri e Piccoli equivoci> al Festival dei due mondi a Spoleto, A piedi nudi nel parco (Barefoot in the Park) di Neil Simon e Zorro, un monologo scritto dalla moglie Margaret Mazzantini, da lui anche diretta nella commedia originale che la Mazzantini aveva ideato, Manola>.

Mentre proseguiva una carriera di successo sul palcoscenico, l’attore ha esordito al cinema nel 1982 assieme a Marcello Mastroianni, Michel Piccoli e Anouk Aimée ne L’Armata ritorna> di Luciano Tovoli, per poi collaborare l’anno dopo con Stefania Sandrelli ne Il Momento magico>
Ha continuato a lavorare nel cinema italiano con alcuni dei migliori registi giovani come Marco Colli (Giovanni Senzapensieri) e Felice Farina (Sembra morto… ma è solo svenuto), per il quale Castellitto è stato anche autore del soggetto e della sceneggiatura. Nel 1986, ha affiancato Vittorio Gassman e Fanny Ardant nella saga di Ettore Scola La Famiglia>, che ha conquistato una candidatura agli Oscar come miglior film straniero e si è aggiudicata cinque David di Donatello, tra cui quello per il miglior film.
Ha poi ritrovato l’attrice Fanny Ardant in Paura e amore> di Margarethe von Trotta, per poi recitare assieme a Jean Reno e Rosanna Arquette nell’acclamato dramma di Luc Besson Le Grand Bleu>, che è stato candidato ai César come miglior film. Ha ottenuto il suo primo David di Donatello (come miglior attore non protagonista) affiancando Gian Maria Volontè in Tre colonne in cronaca>.
Successivamente Castellitto è passato a ruoli da protagonista nell’adattamento cinematografico del testo teatrale di Claudio Bigagli Piccoli equivoci> (in cui riprendeva il ruolo di Paolo), La carne>, Rossini! Rossini!> di Mario Monicelli, L’Uomo delle stelle> di Giuseppe Tornatore (candidato all’Oscar per il miglior film straniero nel 1996, grazie al quale ha anche ottenuto il Nastro d'Argento) e Il Grande Cocomero> di Francesca Archibugi, per cui ha vinto il suo secondo David di Donatello, questa volta come miglior attore protagonista. Alla fine degli anni novanta, l’attore è passato alla regia per la prima volta con Libero Burro>, di cui aveva anche realizzato la sceneggiatura con la moglie Margaret Mazzantini, sua coprotagonista nella pellicola, aggiudicandosi il titolo di miglior film ai Los Angeles Italian Film Awards.
Oltre ad un’importante carriera in Italia, Castellitto è diventato molto popolare in Francia grazie a pellicole come In viaggio con Alberto (Alberto Express) e Ne Quittez Pas di Arthur Joffé, A vendre - in vendita (A Vendre) di Laetitia Masson e Le Cri De La Soie di Yvon Marciano.
Nel 2001, ha ritrovato il regista Ettore Scola nell’acclamato dramma Concorrenza sleale>, per poi ottenere dei consensi internazionali nei panni di Ugo, il responsabile artistico di una troupe teatrale italiana in visita a Parigi in Va savoir> di Jacques Rivette. In seguito, è stato il volubile chef nell’acclamata commedia internazionale Ricette d'amore> (Bella Martha), che gli è valsa il riconoscimento come migliore attore agli European Film Award, per poi trionfare nella commedia dolceamara Caterina va in città>, per la quale si è aggiudicato il suo secondo Nastro d'Argento. Ha ottenuto la sua terza candidatura ai David per il premiato dramma di Marco Bellocchio L’Ora di religione>. Recentemente, ha ritrovato questo regista per Il regista di matrimoni>, oltre a partecipare al dramma La Stella che non c'è> di Gianni Amelio e a prestare la sua voce alla versione francese di Arthur e il popolo dei Minimei> (Arthur et les Minimoys). E’ l’unico attore italiano presente nel progetto-omaggio a Parigi, Paris Je T'Aime, in un episodio diretto da Isabel Coixet.
In televisione, ha lavorato alla miniserie Cinema con Alain Delon, alle importanti storie biografiche Don Milani - Il priore di Barbiana, Il Grande Fausto> (sulla vita di Fausto Coppi), Padre Pio ed Enzo Ferrari (gli ultimi due diretti da Carlo Carlei), Victoire, ou la douleur des femmes di Nadine Trintignant, e a due progetti di cui è anche stato cosceneggiatore, Il Commissario Maigret : L'ombra cinese> e Il commissario Maigret: La trappola di Maigret>, entrambi assieme a Margherita Buy. Il suo impegno televisivo più recente è stato O' Professore, scritto da Stefano Rulli e Sandro Petraglia, per la regia di Maurizio Zaccaro.
Oltre a cosceneggiare un nuovo film con la moglie Margaret Mazzantini (di cui sarà anche regista), Castellitto è tornato in teatro per dirigere il premiato testo di John Patrick Shanley Il dubbio (Doubt).