Nato a Brooklyn, Buscemi ha iniziato a recitare durante l’ultimo anno del liceo. Poco dopo, si è trasferito a Manhattan e ha studiato con John Strasberg. E lì che con il collega attore/autore, Mark Boone Junior, ha iniziato a scrivere e interpretare i suoi testi negli spazi teatrali del downtown. Trovò presto la sua prima scrittura da protagonista in Parting Glances di Bill Sherwood, nel ruolo di un musicista malato di AIDS. Da allora, è diventato l’attore preferito di molti fra i più rinomati registi. Con Mystery Train di Jim Jarmusch ha ricevuto la nomination all’ IFP Spirit Award; In The Soup di Alexander Rockwell ha vinto il Premio della Giuria al Sundance Film Festival 1992; ha inoltre lavorato in: New York Stories di Martin Scorsese, Crocevia della morte, Barton Fink, Il Grande Lebowski e il vincitore del Premio Oscar Fargo dei fratelli Coen; Gli imbroglioni di Stanley Tucci; le produzioni Con Air e Armageddon di Jerry Bruckheimer; Si gira a Manhattan di Tom DiCillo vincitore al Sundance Film Festival, con Dermot Mulroney e Catherine Keener; Un pezzo da 20; Fuga da Los Angeles di John Carpenter con Kurt Russell; Desperado; Domestic Disturbance con John Travolta e Vince Vaughn; Somebody to Love di Alexander Rockwell con Rosie Perez, in cui interpretava un ballerino travestito; Le iene di Quentin Tarantino con il quale, per il ruolo di Mr. Pink ha vinto l’ IFP Spirit Award; Kansas City di Robert Altman e numerosi ruoli “cameo” in film come Sol Levante, Mister Hula Hoop, Big Daddy-un papà speciale, Prima o poi me lo sposo e altri ancora.

Oltre al suo talento come attore, Buscemi si è rivelato bravissimo scrittore e regista. Il suo primo lavoro è stato il corto What Happened to Pete?, presentato in numerosi festival fra cui Rotterdam e Locarno e trasmesso dal network Bravo. Ha inoltre scritto e interpretato il primo lungometraggio che ha diretto, Mosche da bar. Nel film recitano anche Chloe Sevigny, Sam Jackson e Anthony LaPaglia, ed è stato presentato al Festival di Cannes nella Quinzaine nel 1996.
Il suo secondo film da regista, Animal Factory, racconta di un giovane finito in prigione con una sentenza ingiustamente dura, che finisce col trasformarsi nel prodotto dell’ambiente in cui è stato catapultato. Il film, tratto da un libro di Edward Bunker, ha come protagonisti Willem Dafoe e Edward Furlong, ed è stato presentato al Sundance Film Festival nel 2000.