Nato nel 1905 in Virginia, Joseph Cheshire Cotten, prima di diventare attore per il cinema lavora come pubblicitario, attore e critico teatrale.
Nel 1930 comincia la carriera artistica in una piccola compagnia teatrale di Miami, e successivamente recita al fianco di Katharine Hephurn nella commedia The Philadelphia story. Il salto verso il grande schermo arriva grazie alla sua amicizia di lunga data con Orson Welles, risalente ai tempi della militanza comune al Federal Theatre ed alla Compagnia Mercury. Cotton esordisce al cinema insieme a Welles con il quale realizza Quarto potere, L'orgoglio degli Ambersons e Terrore sul Mar Nero. La sua aria introversa e riflessiva, la sua immagine buona e pacifica, vengono completamente ribaltate da Alfred Hitchcock, che gli affida il ruolo del cattivo diabolico ne L'ombra del dubbio, traendone un personaggio tanto più inquietante quanto più in contrasto con la sua apparenza di decoro e rispettabilità - in seguito Cotten reciterà ancora per Hitchcock ne Il peccato di Lady Considine (1949).
Tra i suoi maggiori successi vanno senz'altro citati Il terzo uomo (1949), Niagara (1953), Piano, piano dolce Carlotta (1965), Petulia (1968) e Lo scopone scientifico (1972). Dagli anni '50 in avanti, Cotten è apparso da coprotagonista accanto a divi più popolari in film decisamente più commerciali - ad esempio produzioni spagnole e italiane di film dell'orrore, polizieschi e western.
Negli anni '70 Cotton ha diradato le sue apparizioni cinematografiche, preferendo dedeicarsi ad amministrare la società televisiva da lui stesso fondata. Nel 1987 ha inoltre pubblicato l'autobiografia intitolata 'Vanity Will Get you Somewhere'. Cotten è morto nel 1994 in un ospedale di Los Angeles per un attacco di polmonite