Nata a Endicott, New York, cresciuta però a Raleigh, nel North Caroline, Amy Sedaris viene al mondo in una famiglia di origini greche, per di più di religione ortodossa. Dopo gli studi, decide di trasferirsi a Greenwich Village, a New York City, dove dotata di un incredibile senso dell'umorismo si iscrive alla Second City and Annoyance Theatre di Chicago, dove sviluppa il suo senso comico, lavorando, occasionalmente anche come cameriera e cuoca per mantenersi. Una volta raggiunto il successo nel cabaret, si trasferisce repentinamente nel piccolo schermo partecipando a numerosi talk show come: "The Late show with David Letterman"; "Late Night With Conan O'Brien"; "Jimmy Kimmel Live!"; "The Late Late Show with Craig Ferguson"; "The Daily Show" e "The Colbert Report". Spesso collabora con suo fratello maggiore, lo scrittore satirico David Sedaris con il quale crea il personaggio di Jerri Blank che diventerà notissima a tutto il continente americano. Nel frattempo, continua a passare nel piccolo schermo, recitando nel film tv Big Deals (1991) con Tim Curry e apparendo nel programma "Exit 57" (1995-1996).

I film
Dopo aver partecipato al cortometraggio Bad Gosses Go To Hell (1997) di Erin Cramer, appare per la prima volta in un film: Commandments (1997) di Daniel Taplitz con Aidan Quinn, Courtney Cox e Anthony LaPaglia. Altri film cui parteciperà sono: Sei giorni sette notti (1998) con Harrison Ford; Un amore a 5 stelle (2002); The School of Rock (2003); Elf (2003); Neurotica (2004); Il padre di mio figlio (2004); Stay - Nel labirinto della mente (2005); Romance & Cigarettes (2005) con Susan Sarandon e Christopher Walken; Vita da strega (2005) con Nicole Kidman e Michael Caine; Jennifer's body (2009) e Daddy Sitter (2009) con John Travolta e Robin Williams.

Il personaggio di Jerri Blank
Un capitolo a parte della sua carriera è il già citato personaggio di Jerri Blank, ex prostituta bisessuale, che all'età di 46 decide di tornare al liceo! La trasformazione la rende l'icona comica degli Anni Duemila, prima con il telefilm Strangers with candy (1999-2000) e poi con il film omonimo del 2005, diretta da Paul Dinello e con Ian Holm.

I telefilm
Televisivamente, recita in telefilm come: Fling con il defunto Sydney Pollack; Sex and the City (2002-2003); Detective Monk (2002-2003); My Name Is Earl (2006); Sesamo apriti (2006) e The Closer (2009).

Il doppiaggio
Menzione speciale per il suo lavoro nel doppiaggio: Chicken Little (2005), Supercuccioli nello spazio (2009), American Dad! (2009), Shrek (2007) e Shrek e vissero felici e contenti (2010) con Eddie Murphy, Cameron Diaz, Antonio Banderas e Julie Andrews.