Vincitore dei premi Tony, Emmy, e Screen Actors Guild, Nathan Lane ha recitato nella primavera del 2012 nella produzione del Goodman Theatre "The Iceman Cometh" al fianco di Brian Dennehy. Nell'autunno del 2012, ha debuttato come ospite nel drama della CBS The Good Wife. Nel 2013, recita in "The Nance" al Lyceum Theatre di New York. Nel 2009, prende parte all'acclamata produzione dello Studio 54 di "Waiting for Godot". Compare a Broadway nella commedia di David Mamet "November" e nel 2006 recita in "Butley". Prende parte inoltre al blockbuster di Broadway "The Odd Couple" di Neil Simon e all'adattamento di Stephen Sondheim delle "Rane" di Aristofane.
Il suo acclamato ritratto di Max Bialystock in "The Producers" gli ha fatto guadagnare a il Drama Desk, Outer Critics Circle e Tony Awards come mi gliore attore in un musical. Nathan ha vinto inoltre l'Olivier Award per la sua interpretazione in "The Producers".
Il pubblico cinematografico ricorda la sua interpretazione nel ruolo di Albert in The Birdcage (1996) di Mike Nichols, che contribuì a far diventare il film un grande successo al botteghino. La parte fece guadagnare a Lane lo Screen Actors Guild Award e una nomination ai Golden Globe. È stato nominato ai Golden Globe anche per il suo ritratto di Max Bialystock nella versione cinematografica del musical vincitore dei Tony Awards The Producers. Ha inoltre avuto molto successo come voce di "Timon" in The Lion King. Tra gli altri film troviamo: Isn't She Great?, Trixie, Love's Labours Lost, Addams Family Values, Life with Mikey, Frankie & Johnny, He Said-She Said; Ironweed.